體視鏡落射熒光照明圖解
最近，研究者已經(jīng)可以在配有高數(shù)值孔徑物鏡的顯微鏡上搭配熒光觀察方法。隨著生物特異性的熒光蛋白（如綠色熒光蛋白，GFP）的出現(xiàn)，熒光觀察也開始出現(xiàn)在體視鏡上。
由于體視鏡的視野及工作距離大，通過體視鏡熒光照明，研究者可以分辨出表達熒光蛋白的生物，如線蟲，斑馬魚，卵母細胞，成熟的昆蟲等。同時，研究者們可使用鑷子，滴管或其他顯微操作設(shè)備處理樣品。另外，在體視鏡下，體視熒光照明更利于樣品的觀察記錄。
體視鏡的熒光照明器與復(fù)合式顯微上的相同。熒光照明器中有氙燈或汞燈作為光源，外罩一個燈室，燈室通過垂直照明器與顯微鏡機身相連。如Figure1,2，垂直照明器位于機身的變倍體與觀察筒之間。
下面我們以Nikon SMZ1500體視鏡為例，介紹下體視熒光的光路。
由光源發(fā)出的光經(jīng)過匯聚透鏡到達濾色塊組中的激發(fā)光濾光片，在這里，光源中的光只有一部分（某段特定的波長）能夠通過濾片。透過濾片的光被半透半反鏡反射，經(jīng)過機身下部的變倍體透鏡組，物鏡，到達樣品。半透半反鏡的具有反射小于特定波長的光，而使大于特定波長的光透過的特性。
透過物鏡的光已倒錐形照射到樣品上，激發(fā)與之相應(yīng)的熒光物質(zhì)。發(fā)射出的熒光透過物鏡，中間變倍體，到達發(fā)射光濾光片；在這里，又會有一部分光被濾掉，只有被激發(fā)出的熒光會通過發(fā)射光濾光片。Figure1,2 中顯示的為光路構(gòu)想圖。左側(cè)的光路中，發(fā)射出的熒光直透過達發(fā)射光濾光片，然后進入相機或目鏡觀察筒；右側(cè)的光路中的發(fā)射光要先透過過半透半反鏡，再透過發(fā)射光濾光片，最后進入目鏡觀察筒。
Figure2,3為熒光濾色塊組示意圖。每個濾色塊組有一個半透半反鏡，一個激發(fā)光濾光片，兩個發(fā)射光濾光片。如前面介紹的，由光源發(fā)出的光透過激發(fā)光濾光片進入濾色塊組，被半透半反鏡反射；發(fā)射出的熒光透過發(fā)射光濾光片進入目鏡或相機。在這一組合中，半透半反鏡以及左側(cè)的發(fā)射光濾光片是固定在架子上的，而右側(cè)的發(fā)射光濾光片則安裝在一個可以拆卸的濾片框內(nèi)。只要松動螺絲，就可以拆下右側(cè)的濾片框，然后根據(jù)需要，更換半透半反鏡。更換時需要注意，不要把固定用的膠水，涂到半透半反鏡上，操作要帶手套，避免將指紋留在鏡面上。
上述體視鏡可搭配3各熒光濾色塊，以及一個用于明場觀察的無濾片塊。觀察時，可通過拉動杠桿調(diào)節(jié)濾色塊的位置，每一個濾色塊配有不同的標(biāo)識，便于選擇。
Table1中為Nikon提供的多種濾色片組合。這些濾色片涵蓋了熒光激發(fā)/發(fā)射的大部分波長范圍（激發(fā)波段380nm-510nm的染料都適用），適用于生物學(xué)研究及工業(yè)研究。同時，下列組合也適用于綠色熒光蛋白變種的研究，如cyan及藍色熒光蛋白。在活細胞觀察中，選擇適當(dāng)?shù)臑V色片組合會極大的提高信號的強度。另外，考慮到葉綠素的自發(fā)熒光，當(dāng)選擇為植物觀察特別設(shè)計的濾片組。
體視鏡熒光濾片組合:
| 濾片組 | 激發(fā)光波段 | 半透半反鏡 | 發(fā)射光波段 |
| Blue GFP/DAPI | 379-401 nm | 420 nm (DCLP) | 435-485 nm |
| Cyan (EGFP) GFP | 426-446 nm | 455 (DCLP) | 460-500 nm |
| Endow GFP 帶通 | HQ 450-490 nm | Q 495 (LP) | 500-550 nm |
| Endow GFP 長通 | HQ 450-490 nm | Q 495 (LP) | 500 nm (LP) |
| TRITC (DsRed) | HQ 530-560 nm | Q 570 (LP) | 590-650 nm |
| Yellow GFP 帶通 | HQ 490-510 nm | Q 515 (LP) | 520-550 nm |
長時間高強度光照及紫外線照射將會對濾色片造成損害，另外，環(huán)境的濕度也會對濾片的帶通造成影響。為了延長濾片的使用壽命，應(yīng)該將濾片儲存在干燥器中，或者放置在有干燥器的密封箱內(nèi)。同時，應(yīng)當(dāng)減少濾片的曝光的時間，如不觀察的時候應(yīng)該關(guān)閉光源的光閘，保護濾片。清潔濾片時應(yīng)使用洗耳球，駝毛刷，或無油的氣體加壓器通過干燥的空氣進行清潔。千萬不可以使用擦鏡紙，它們會劃傷濾片上的鍍膜。
以Nikon SMZ1500為例，這款體視鏡的放大倍數(shù)為4x到540x，接近一臺復(fù)合式顯微鏡的放大倍數(shù)。研究者可以通過這樣的體視鏡觀察大體積的活樣品，或經(jīng)熒光標(biāo)記的薄切片。Figure4為三色熒光染色的小鼠腎臟切片。使用的染料分別為DAPI, Alexa Fluor 488 WGA, 及 Alexa Fluor 568，相應(yīng)的濾色片為Table1中的Blue GFP/DAPI, Endow GFP Bandpass, 及 TRITC DsRed。這張圖片體現(xiàn)了體視鏡具備了觀察復(fù)合式顯微鏡樣品的能力。
其他的顯微鏡制造商有著不同的提示熒光照明設(shè)計，如Figure5中為比較主流的模式之一。在這一設(shè)計中，有一個獨立于成像光路的熒光照明通道。由光源發(fā)出的光首先經(jīng)過激發(fā)光濾色片，然后通過主機后方的通道到達底部的透鏡組，這些透鏡組將光傳導(dǎo)到樣品上。這樣的設(shè)計保證了無論在何種放大倍數(shù)下，激發(fā)光都會直接照射在樣品上，范圍，發(fā)射光強度，黑背景都不隨放大倍數(shù)改變。發(fā)射出的熒光通過物鏡到達變倍體最后透過發(fā)射光濾光片，進入目鏡用于觀察或進入相機。這一設(shè)計主要的優(yōu)勢在于取消了半透半反鏡，并且濾片的組合可變，研究者可選的范圍很大。然而，這也帶來了相應(yīng)的問題，如，沒有經(jīng)驗的操作者可能會因為選擇了錯誤濾片組合而觀察不到熒光。
由汞燈產(chǎn)生的強紫外線會損傷觀察者的視網(wǎng)膜。許多廠家為了避免這一事故都引用了保護設(shè)施濾掉照射在樣品及載物臺上的紫外線。同時還有很多其他的保護措施，如在光路中加入濾片。體視熒光鏡中通常在燈箱及垂直照明器之間裝有光閘，當(dāng)不觀察樣品或不照相時，光閘將會關(guān)閉，以保護樣品不受長時間紫外線的傷害。有時在高倍平場復(fù)消色差物鏡（1.6x至2.0x）配合低變倍比的情況下，視野里較低的部分可能會出現(xiàn)反射及hot spots現(xiàn)象。這一假象通常在調(diào)高變倍比時消失。而且在使用低放大倍數(shù)物鏡（0.5x或1.0x）以及高放大倍數(shù)低校正物鏡（消色差物鏡，平場消色差物鏡）時不會出現(xiàn)這一假象。使用體視鏡可以觀察很多種樣品，如Table2,從生物到工業(yè)制造。
體視鏡熒光的應(yīng)用
| 領(lǐng)域 | 應(yīng)用 |
| 生物學(xué) | 基因表達，細胞分類，解剖，發(fā)育過程，眼及肌肉的研究 |
| 植物學(xué) | 植物細胞，組織自發(fā)熒光，鼓勵樣品，寄生蟲 |
| 藥理學(xué) | 毛細流動,藥物，觀察 |
| 水文學(xué) | 水質(zhì)，細胞結(jié)構(gòu)，濾膜分析 |
| 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟學(xué) | 種子觀察，基因表達，轉(zhuǎn)基因 |
| 電子學(xué) | 焊膏，環(huán)氧樹脂分析，顯示器涂料，集成電路聚合物鑄件 |
| 半導(dǎo)體 | 光阻污染，外來顆粒，加工錯誤 |
| 聚合物 | 外來顆粒，空隙，珠粒分析，非聚合區(qū)域 |
| 金屬制造 | 裂縫及表面缺陷，污染，焊接控制，斷口分析 |
| 材料 | 裂縫，焊接，碳鍵，斷裂，定位研究 |
| 造紙 | 纖維包被及內(nèi)含物 |
| 法醫(yī)學(xué) | 紡織纖維，體液，指紋，銀行票據(jù)，贗品 |
與復(fù)合式顯微鏡相比，大工作距離及景深使體視熒光能夠提供全景信息并觀察高強度熒光。這些特性為研究者們帶來了很多便利，比如可以操作大的生物樣品，或者材料技術(shù)師可在此進行包埋，檢查電子元件，或切割。現(xiàn)在特殊用途的濾片組合越來越豐富，體視熒光鏡也將得到更好的發(fā)展。